ViralStars^TM  Lentivirus Packaging Cell Line

Catalog Number：CL110001

01/產(chǎn)品概述

慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能使外源基因整合入宿主細(xì)胞的基因組，實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定、長期的表達(dá)，比一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體（產(chǎn)生病毒顆粒所需的輔助蛋白）一同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，即可進(jìn)行病毒的包裝。包裝好的慢病毒為假型病毒（病毒感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞，也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，慢病毒中的毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代），分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，經(jīng)過離心取得上清液后進(jìn)行慢病毒濃縮，濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)（下圖）。

要充分利用慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生高滴度的慢病毒顆粒，就需要宿主細(xì)胞系具備易于轉(zhuǎn)染并且可以高水平表達(dá)病毒蛋白質(zhì)的特性。我們的ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經(jīng)過了克隆篩選，可以充分滿足這些需求。當(dāng)與我們優(yōu)質(zhì)的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時(shí)，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達(dá)10⁸ TU/mL）。ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line是人胚胎腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞HEK 293的亞克隆，經(jīng)過基因編輯改進(jìn)后篩選出的單克隆細(xì)胞株，具備高細(xì)胞活性、低細(xì)胞凋亡水平、可高度轉(zhuǎn)染并高水平表達(dá)病毒蛋白質(zhì)等特性。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

為確保細(xì)胞活力，細(xì)胞產(chǎn)品接收后應(yīng)立即進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及后續(xù)操作（詳見05/實(shí)驗(yàn)步驟）。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

2 高細(xì)胞活性、低細(xì)胞凋亡水平

2 高度易于轉(zhuǎn)染

2 高水平表達(dá)重組慢病毒

05/實(shí)驗(yàn)步驟

一、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細(xì)胞傳代

1. 待細(xì)胞密度達(dá)90% 左右，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入適量胰酶消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞約1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若觀察到大部分細(xì)胞變圓并脫落，則迅速拿回操作臺，加入與胰酶等量的*培養(yǎng)基（DMEM，10% FBS，1% 雙抗）終止消化。

3. 輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞*脫落后吸出，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

4. 將細(xì)胞懸液按合適的比例（推薦1:4-1:5）接種到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

二、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細(xì)胞凍存

1. 選擇處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，按照常規(guī)方法收集細(xì)胞于離心管中。

2. 1000 rpm，離心5分鐘，收集培養(yǎng)細(xì)胞沉淀，棄上清液。

3. 加入適量4℃預(yù)冷的LeapWal Cell Freezing Medium (1x)(PZ110R) 重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。

? 按照細(xì)胞密度和所用細(xì)胞凍存管的尺寸計(jì)算所需凍存液的量，推薦凍存密度：1x10⁶ 至5x10⁶ cells/mL。

4. 將細(xì)胞懸液分裝至已標(biāo)記的凍存管中，建議每管1mL或1.5mL。

5. 直接將細(xì)胞凍存管放入-80℃超低溫冰箱中，可長期冷凍保存。如果想放入液氮中長期保存，需先放入-80℃冰箱至少12小時(shí)，方可移至液氮罐中長期保存。

三、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細(xì)胞復(fù)蘇

1. 在15 mL離心管中加入5-10 mL平衡至室溫的*培養(yǎng)基。

2. 從-80℃冰箱/液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴鍋或其他細(xì)胞復(fù)蘇設(shè)備中，迅速解凍。

3. 將凍存管中的細(xì)胞懸液逐滴轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的含*培養(yǎng)基的離心管中，1000 rpm，離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀，棄上清（操作時(shí)小心，切勿將細(xì)胞沉淀移去）。

4. 加入適量平衡至室溫的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)容器中，輕輕搖晃培養(yǎng)容器，使細(xì)胞分布均勻。

5. 培養(yǎng)5-16 h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，可視情況更換預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)液，之后進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。

06/適用范圍

ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經(jīng)過了基因編輯及單克隆篩選，具備高細(xì)胞活性、低細(xì)胞凋亡水平、可高度轉(zhuǎn)染并高水平表達(dá)病毒蛋白等特性，兼容所有慢病毒包裝體系。

07/注意事項(xiàng)

1. 該產(chǎn)品與我們優(yōu)質(zhì)的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時(shí)，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達(dá)10⁸ TU/mL）。

2. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

3. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全柜中進(jìn)行。

4. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

08/實(shí)驗(yàn)案例分析

1. 提前一天使用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）及其它兩種常用HEK 293包裝細(xì)胞系（HEK293T、293FT），待細(xì)胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝。取3個(gè)2 mL EP管，分別加入10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)粒混合物（Package Plasmid Mix），2.5 μL表達(dá)GFP的對照質(zhì)粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合，室溫孵育3分鐘。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

4. 將上述1.8 mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，做好標(biāo)記，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

5. 轉(zhuǎn)染24 h后，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 轉(zhuǎn)染48 h后，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

7. 轉(zhuǎn)染72 h后，進(jìn)行二次病毒上清液收集，與48 h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）分別重懸三組慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測定病毒滴度。

(1) Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞

對生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至?1-3x10⁵個(gè)?/mL?，加入96孔板，100?μL/孔（1-3x10⁴個(gè)?/孔），每?種慢病毒設(shè)6個(gè)梯度孔，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) Day2：病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管，每個(gè)EP管中加?90μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液10 μL加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記10 μL），混勻后取10 μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記1 μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標(biāo)記，??操作，不要吹起細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

(3) Day3：棄病毒，換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中再加入?100 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

(4) Day4：熒光計(jì)數(shù)與滴度計(jì)算

感染36-48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)對熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個(gè)梯度進(jìn)行陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出病毒滴度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2: ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line慢病毒包裝細(xì)胞系可制備出更高滴度的慢病毒顆粒。

我們使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝，比較ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line和其它兩種常用HEK 293包裝細(xì)胞系的病毒制備能力，ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line明顯優(yōu)于其他細(xì)胞系——所獲得的病毒滴度比293FT細(xì)胞高出10倍，比親代HEK 293細(xì)胞系高出26倍。

09/其他相關(guān)產(chǎn)品