PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent

DNA transfection reagent for large scale recombinant protein expression and virus production

CatalogNumber：P09310

01/產(chǎn)品概述

　　PEI是基因轉(zhuǎn)染中常用的高分子載體，同時(shí)也是基因轉(zhuǎn)染的“金標(biāo)準(zhǔn)"。PEI轉(zhuǎn)染的原理是帶正電的陽(yáng)離子聚合物與核酸中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后，再與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，通過(guò)細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞。PEI主鏈上每三個(gè)原子就含有一個(gè)氮原子，因此具有較高的陽(yáng)離子密度，這對(duì)于結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸分子是非常有利的。在生理pH條件下，PEI部分胺基被質(zhì)子化，隨著體系pH值的降低，PEI剩余的胺基被質(zhì)子化，從而賦予了其出色的核酸結(jié)合能力和質(zhì)子緩沖能力，有利于通過(guò)質(zhì)子海綿效應(yīng)從內(nèi)涵體逃逸。但是，PEI高的陽(yáng)離子電荷密度，導(dǎo)致其嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。同時(shí)，PEI25K含有4%-11％的殘留丙酰基，這可能阻礙聚合物主鏈與DNA的有效結(jié)合，影響基因轉(zhuǎn)染效率。因此，針對(duì)PEI的研究工作主要聚焦在通過(guò)功能化修飾以及脫丙酰基，來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率、降低細(xì)胞毒性。

　　LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于分子量25kDaPEI的DNA轉(zhuǎn)染試劑。通過(guò)對(duì)PEI進(jìn)行功能改性，NEO-PEI丙酰基*脫落，顯著改善了PEI的基因遞送性能，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和較低的細(xì)胞毒性。PolyShooterNEO-PEI與PEI25000轉(zhuǎn)染試劑相比，具有很多優(yōu)點(diǎn)。包括：

　　1.PolyShooterNEO-PEI為即用型轉(zhuǎn)染試劑，無(wú)需配置，可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，而PEI25000需要先把水調(diào)成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調(diào)至中性，配置過(guò)程繁瑣復(fù)雜，容易引入誤差導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定。PEI40000雖然較PEI25000更易溶解，但也同樣存在配置繁瑣，配置過(guò)程中容易引入誤差的風(fēng)險(xiǎn)。

　　2.PEI25000含有4%-11%的丙酰基殘留，丙酰基會(huì)阻止聚合物主鏈與DNA結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染效果。相較于PEI25000，PolyShooterNEO-PEI丙酰基*脫落，因此其性能始終高效如一。

　　LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種功能強(qiáng)大、值得信賴(lài)且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑，廣泛適用于多種細(xì)胞系，包括HEK-293、HEK-293T、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3、Sf9、HepG2和HeLa細(xì)胞等。同時(shí)，PolyShooterNEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑在大規(guī)模重組蛋白表達(dá)和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域有著高效、低毒、穩(wěn)定、可靠等顯著優(yōu)勢(shì)。PolyShooterNEO-PEI提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達(dá)轉(zhuǎn)染體系，實(shí)現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過(guò)度。與大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方案相比，使用PolyShooterNEO-PEI既能得到穩(wěn)定的基因表達(dá)效率，又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本；

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運(yùn)輸。4℃保存，有效期6個(gè)月。-30℃至-10℃保存，有效期12個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

　　易于使用——即用型轉(zhuǎn)染試劑，無(wú)需配置，可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

　　轉(zhuǎn)染效率高——針對(duì)多種類(lèi)型細(xì)胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達(dá)

細(xì)胞毒性低——作用溫和，能更好地實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡

　　性能更穩(wěn)定——丙酰基*脫落，性能始終高效如一

　　高性?xún)r(jià)比——既能得到穩(wěn)定的基因表達(dá)效率，又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本

　　化學(xué)成分明確，不含動(dòng)物來(lái)源成分

05/適用范圍

PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent 廣泛適用于多種細(xì)胞系的DNA轉(zhuǎn)染，可應(yīng)用于大規(guī)模重組蛋白表達(dá)和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域。本試劑提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達(dá)轉(zhuǎn)染體系，實(shí)現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過(guò)度。

06/實(shí)驗(yàn)流程概要

圖1: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)流程圖

07/實(shí)驗(yàn)步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)）

1:準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將消化后的細(xì)胞按照每孔0.3-2x10^5個(gè)細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為60%-70%。

　　懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每500µL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入2-5x10^5個(gè)細(xì)胞。

　　?細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2:準(zhǔn)備PolyShooterNEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

　　（1）取1μg質(zhì)粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL*PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合，室溫孵育3分鐘。

　　?*PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類(lèi)型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響，通常情況下，DNA（μg）和PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑（μL）的推薦使用比例為1：2.5。建議初次使用時(shí)，可在1：1-1：5的范圍內(nèi)調(diào)整以?xún)?yōu)化轉(zhuǎn)染效果。

　　（2）往上述混合物中加入100μL無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基1（與培養(yǎng)體系一致，且無(wú)血清無(wú)雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　?PolyShooter NEO-PEI 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。

　　（3）30分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150μL無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基2（與培養(yǎng)體系一致，且無(wú)血清無(wú)雙抗）稀釋復(fù)合物。

3:細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，將上述250µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4-16小時(shí)后，給細(xì)胞補(bǔ)充新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基500µL/孔。

4:分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)36-48小時(shí)后，可根據(jù)實(shí)際情況用熒光檢測(cè)法、WesternBlot、RT-PCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、報(bào)告基因等檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，或加入篩選藥物進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。

表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)

08/注意事項(xiàng)

1:核酸質(zhì)量：想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性，應(yīng)選用高純度、無(wú)菌、無(wú)污染、無(wú)內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降。推薦使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時(shí)，需合理計(jì)算質(zhì)粒用量，轉(zhuǎn)染過(guò)量的質(zhì)粒可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性甚至死亡；

2:細(xì)胞質(zhì)量：細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

　　3:細(xì)胞密度：建議細(xì)胞傳代后12-24h內(nèi)、細(xì)胞密度為60%-70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時(shí)，需要根據(jù)說(shuō)明書(shū)再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證相同的接種條件，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；

　　4:質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA(μg)與PolyShooteNEO-PEITransfectionReagent(μL)的比例在1：1至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得轉(zhuǎn)染結(jié)果，需要對(duì)這一比例進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例；

　　5:PolyShooterNEO-PEITransfectionReagent也可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，但通過(guò)我們實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試，我們認(rèn)為體系中血清的存在會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效果有一定程度的干擾，所以，為了追求更高效的轉(zhuǎn)染效率，我們更推薦使用無(wú)血清轉(zhuǎn)染法（即“07/實(shí)驗(yàn)步驟"中敘述的轉(zhuǎn)染方法）；

　　6:由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會(huì)抑制陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測(cè)特殊培養(yǎng)基與PolyShooterNEO-PEITransfectionReagent的相容性；

　　7:為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；

　　8:本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

09/實(shí)驗(yàn)案例分析

　　1:轉(zhuǎn)染前一天，將圖2所示3種狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為60%-70%。

　　2:按照每孔計(jì)量，取1μgGFP質(zhì)粒加入到1.5mL離心管中，PolyShooterNEO-PEI組（圖2上）加入2.5μLPolyShooterNEO-PEITransfectionReagent與質(zhì)粒混合，PEI組（圖2下）加入2.5μLPEI25k與質(zhì)粒混合。室溫孵育3分鐘后，往混合物中加入100μL無(wú)血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　3:孵育30分鐘后，往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150μL無(wú)血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物。

　　4:將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，加入上述250µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　5:轉(zhuǎn)染12小時(shí)后，給細(xì)胞補(bǔ)充新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基500µL/孔。

　　6:轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并拍照記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2:轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后，用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況

10/其他相關(guān)產(chǎn)品